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墨滴

留胡子的豆腐

2021/12/29  阅读:55  主题:橙心

mRNA帽子

真核生物mRNA 5'末端帽子结构是非常关键的组成部分,在mRNA stability,mRNA transport,protein synthesis方面发挥极其重要的功能。在mRNA体外合成反应中,可以通过2种方法完成mRNA 5'末端的加帽:

  1. 酶法加帽

    成本相对较低,但是多了加帽和甲基化步骤,引入了两个额外的蛋白和SAM,工艺步骤变繁琐,增添QC检测项。

  2. 共转录加帽

    一步到位,合成结束,可直接纯化,缺点是 Cap analogs 成本昂贵。考虑到未来随着技术的不断进步,帽子类似物合成方式取得新突破,成本必将发生大幅下降,因此共转录加帽必然成为未来mRNA合成的绝对主流。

mRNA体外转录的两种加帽方式
mRNA体外转录的两种加帽方式

那么,我们有必要了解mRNA帽子结构相关的理论,有助于mRNA-based drug 研发工作。

Methylation modifications in eukaryotic mRNA

甲基化是mRNA最为常见的一种化学修饰,普遍存在于各种物种的细胞中。mRNA甲基化主要是攻击嘌呤碱基和嘧啶碱基杂环上的碳原子,特定的氮原子,环外的氨基以及糖苷五碳环2'-OH的氧原子。目前真核生物mRNA甲基化的类型主要存在以下几种类型:

Cap

  • Cap形成

mRNA 5' Cap加"G"的反应是非常迅速的,很难在体内测到5'自由三磷酸基因的存在。据测算,在新生mRNA链到达50个核苷酸之前,甚至在RNA polymerase II离开转录起始位点之前,Cap就已经添加到mRNA第一个核苷酸上了。也就是说,真核mRNA几乎从一出生,就头顶帽子结构了。

mRNA加帽过程可以分为三个过程:

  1. RNA 5' triphosphate 移除一个磷酸基团形成diphosphate-RNA
  2. RNA guanylyltransferase 把GMP转移到diphosphate-RNA,形成帽子结构
  3. RNA guanine-7-methyltransferase利用SAM作为甲基供体,在鸟嘌呤核苷酸N^7^位置上形成m^7^G cap
Celluar mRNA加帽过程
Celluar mRNA加帽过程

在真菌和动物细胞中,guanylyltransferases 和cap methyltransferases 在结构和机制上是高度保守的,但是RNA triphosphatases是完全不同的。

我们可以看到真核细胞中mRNA加帽反应涉及到三个过程,需要三种不同的酶。但是在体外合成mRNA时,我们用到的是牛痘加帽酶。牛痘病毒加帽酶是催化形成帽子结构的有效酶,其由D1和D12两个亚基组成,兼具RNA三磷酸酯酶活性、鸟苷酰基转移酶活性和鸟嘌呤甲基转移酶活性,可将7-甲基鸟嘌呤帽结构(m7Gppp)连接到RNA的5'末端(m7Gppp5'N)。牛痘病毒加帽酶,在合适浓度的加帽缓冲液(Capping buffer),鸟苷三磷酸(GTP),S-腺苷甲硫氨酸(SAM)等存在条件下,能够在一个小时之内对RNA进行加帽,并且保证正确的方向。

体外转录mRNA,牛痘病毒加帽酶可完成加帽反应
体外转录mRNA,牛痘病毒加帽酶可完成加帽反应
  • Cap功能

其中, Cap的研究较为清楚,其参与的生理学过程主要包括:

  1. mRNA translation

    在真核细胞中,eIF4E(eukaryotic initiation factor 4E)紧密结合到mRNA 5'帽子结构上,与 eIF4G (支架蛋白)和eIF4A (解旋酶) ,形成 eIF4F复合物,参与蛋白质翻译的起始。上述过程称为cap-dependent translation,这是大多数真核mRNA起始蛋白翻译依靠的机制。

    mRNA cap-dependent translation
    mRNA cap-dependent translation
  2. Nuclear export

    有研究报道,在酵母细胞中,帽子结合复合物CBC(Cap-binding complex)可以结合到mRAN 5'末端帽子结构上,通过募集Npl3和Yra1,提升mRNA核输出。此外,CBC还可以促进Sus1 mRNA 剪接,而Sus1 通过TREX-2系统来参与mRNA核输出。由此可以看出,mature RNA从细胞核穿过核孔复合体进入到细胞质,mRNA 5'端帽子结构在此过程中发挥极其重要的作用。

    帽子结合复合物CBC调控mRNA出核过程
    帽子结合复合物CBC调控mRNA出核过程
  3. mRNA stability

    mRNA 5'末端帽子能够被Dcp2(decapping enzymes)去除掉,释放出m7GDP和5' monophosphated RNA,Xrn1(5′-to-3′ exoribonuclease)进而从头开始降解5' monophosphated RNA。有研究报道,在哺乳动物细胞中,DXO具有3种酶活性,pyrophosphohydrolase, decapping, and 5' to-3' exoribonuclease activities,偏好降解一些加帽不完全的mRNA初始转录本。因此,mRNA帽子结构和其稳定性密切相关。

    DXO可降解加帽不完全的mRNA
    DXO可降解加帽不完全的mRNA

  • 形成

m^6^A是细胞内mRNA最丰富的一种修饰,涉及蛋白翻译等多种生理功能。m^6^A也是是第一个发现的mRNA可逆化学修饰,在FTO(human fat mass and obesity associated protein (FTO) 或者ALKBH5(alkylation repair ho- molog 5 )的作用下发生去甲基化,类似于DNA和组蛋白的化学修饰,RNA 化学修饰直接催生出一个新的研究方向—RNA表观遗传学。

  • 功能

蛋白质的翻译一般都是cap-binding complex募集43S核糖体复合物到mRNA 5’末端帽子结构,但是存在一些转录本能够通过cap-independent translation起始蛋白质翻译,有研究发现,mRNA 5’UTR区域存在 时,能够通过cap-independent translation起始蛋白质翻译。5' UTR 可以直接结合eIF3(eukaryotic initiation factor 3),eIF3足以募集43S核糖体复合物,从而在缺乏eIF4E的情况起始蛋白翻译。值得注意的是,当细胞受到各种应激压力时,整个转录组上的m6A会发生重新分布,各种5' UTR -mRNA的数量增加,从而促进细胞在压力状态下的蛋白翻译。

2'-O-methylation

  • 2'-O-methylation形成

在高等真核生物以及其对应的侵染病毒的mRNA 5'末端结构里,第一个转录出来的核苷酸(the first transcribed nucleotide)最常发生的化学修饰是2'-O-methylation,由此形成Cap1或者Cap2。如果第一个核苷酸是A或者 (2'-O- methyladenosine),那么腺嘌呤碱基N6位置还可能发生额外甲基化,形成 或者 m。不同物种的各类细胞中 m / 的比值变化非常大,在人的细胞中,两者比值可以达到最大,在一些特定类型的人细胞中,甚至超过50%。非常有意思的是,mRNA 5'末端第一个腺嘌呤核苷酸,在缺乏2'-O-methylation的情况下,依然可以形成N6-methylation (m^6^A),研究人员发现存在大量此种类型的mRNA。例如,在人B淋巴细胞中,mRNA 5'末端第一个核苷酸出现 m和 的概率是相同的;相反,在小鼠肝脏细胞中,mRNA5'末端第一个核苷酸出现 的概率要比 m出现的概率少十倍。

  • 2'-O-methylation功能

高等哺乳动物细胞mRNA 5'末端存在Cap structure,并且转录出来的第一个核苷酸会发生2'-O-methylation,相反,大部分Virus RNA,形成long strand-RNA(dsRNA),或者产生5' triphosphosphates (PPP- RNA) 或者capped but lack 2'-O-methylation RNA。通过鉴别Virus RNA和 celluar RNA结构上的差异,模式识别受体PRRs(Pattern-Recognition Receptors )可以感知到 Virus RNA,激活细胞抗病毒级联信号通路,诱导Type 1 interferons (IFN) 。IFN通过旁分泌,与邻近细胞的 IFN Receptors结合,触发JAK-STAT信号通路,上调抗病毒相关基因的表达,其中就包括干扰素诱导的四肽重复序列(基因(IFN-induced tetratricopeptide repeat )。有研究显示,IFIT1 and IFIT1B能够同蛋白翻译起始因子eIF4E发生强有力地竞争,阻断Cap0-mRNA启动翻译,相反,IFIT1B and IFIT5需要较高的蛋白浓度才能抑制cap1- and 5'ppp- mRNAs 启动翻译。

IFIT可以阻断Cap 0-mRNA启动翻译
IFIT可以阻断Cap 0-mRNA启动翻译

作为DNA的一种化学修饰,被广泛研究,但是对于 -Cellular RNA 化学修饰一直被仍为仅存在于tRNA和rRNA中,缺乏相关的研究。在2012年,研究人员利用二代测序技术发现,除了发现 human tRNA上存在的胞嘧啶化学修饰位点,在mRNA和non-coding RNAs上面也发现了许多胞嘧啶化学修饰位点,而且此类位点主要集中分布在mRNA UTR区域以及靠近Argonaute结合区域。

mRNA cap type

真核生物mRNA 5'末端帽子结构有一个固定的组成:

m7G+5',5'-triphosphate chain+the first transcirbed nucleotide

在mRNA 5'末端核苷酸不同部位可发生甲基化,从而形成3种帽子结构:

  1. Cap 0 ( GpppN~1~ +mRNA)
  2. Cap 1 ( GpppN~1m~+mRNA)
  3. Cap 2 ( GpppN~1m~N~2m~)
mRNA cap type
mRNA cap type

Cap Analogs

在2009年,Ishikawa使用三核苷酸帽子类似物m7GpppA*pG(A可以是腺嘌呤核苷酸或者甲基腺嘌呤核苷酸)来完成IVT反应中RNA的加帽过程,突破以往IVT加帽反应的诸多限制。合成4种不同的三核苷酸帽子类似物,在腺嘌呤核苷酸2'-OH和N6位置上,存在不同的甲基化:

  1. GpppApG (plant mRNA Type)
  2. GpppA pG (animal mRNA Type)
  3. Gppp A pG (mammalian mRNA Type)
  4. Gppp ApG(unnatural mRNA Type)

利用含有4种不同甲基化腺嘌呤核苷酸的帽子结构类似物,合成出4种不同的mRNA,加入到兔网织红细胞裂解液系统中,研究mRNA 5'端不同甲基化的腺嘌呤核苷酸对mRNA翻译的影响,发现 Gppp A pG-mRNA翻译效率是最高的, GpppApG-mRNA翻译效率最低。这表明哺乳动物mRNA5'端腺嘌呤核苷酸2'-OH和N6位置上的甲基化会影响mRNA蛋白翻译效率。

目前市面上销售的 Cap Analogs 主要存在:

  1. CleancapAG
  2. CleancapGG
  3. CleancapUG
  4. ARCA

聚合酶可以从 G的3'-OH起始转录反应,形成Gppp G-RNA(反向假冒mRNA),通过合成3'-OH甲基化 G(ARCAs),来避免形成反向加帽mRNA。

蓝1
绿2
红3
红4

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总结

帽子结构对于mRNA来说,就像是一定钢盔,既可以保护mRNA免遭荼毒,又能够通过化学修饰在钢盔上加上烙印,便于被其他成员识别。mRNA疫苗研发中,通过共转录方式加帽,能够更加迅速提升mRNA疫苗产能。IVT反应中成本昂贵的修饰核苷酸合成需要进一步做技术突破,降低其生产成本。

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